大鼠视网膜Müller细胞体外培养特性

目的 探讨视网膜Müller细胞(RMCs)体外培养方法,研究其增殖、凋亡特性.方法 将出生7 d的SD大乳鼠处死,分离出视网膜组织并收集于培养皿中,分别加入木瓜蛋白酶(27 U/ml)和0.25％的胰蛋白酶37℃进行消化30 min,使用20％FBS的DMEM/F12培养基终止消化.用移液枪轻轻吹打,接种于6孔培养板,放入37℃、体积分数为5％的CO2培养箱培养.定时观察细胞的生长情况,2～3 d换液1次.当细胞长满培养板的80％～90％时进行消化终止,按1:3传代,移入放有细胞爬片的6孔培养板,置于5％CO2恒温培养箱中培养.在倒置显微镜下观察细胞形态变化.在原代培养5 d时,将细胞爬片取出,进行谷氨酰胺合成酶(GS)、波型蛋白(Vimen-tin)免疫荧光染色.结果 原代培养的RMCs与神经元细胞共同生长,随接种时间延长,逐渐自接种块周边爬行生长,呈扁平的多边形融合状生长,并有较长的突起,传2代时细胞纯化率高,传3～4代时细胞失去原有秩序,体积约有原代的3～4倍,胞质内见明显束状纤维增生.GS主要在Müller细胞胞核和胞质中表达,胞膜不表达,其阳性表达率达80％以上.Vimentin主要在Müller细胞胞质中表达,其阳性表达率达90％以上.结论 本试验通过酶分步消化法以及机械吹打法在体外成功培养并纯化了视网膜Müller细胞,GS和Vimentin均可鉴别视网膜Müller细胞,将二者一起使用可提高Müller细胞鉴别率;随着体外传代培养时间延长,Müller细胞逐渐分化为带有收缩功能的纤维细胞,这可能参与了增生性视网膜病变的发病机制.