中脑星形胶质细胞源性神经营养因子在视网膜Müller细胞中诱导激活p44/42丝裂原活化蛋白激酶信号通路的实验研究

目的 中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)可能对视网膜光感受器细胞和视网膜神经节细胞具有保护性作用.但是其作用机制还不清楚.本研究探索MANF在视网膜上的作用通路,为其在眼科的应用奠定基础.方法 选用Sprague-Dawley雄性大鼠25只,体重0.2～0.25 kg.采用数字表法,随机将大鼠分为未处理组和处理组.其中,未处理组5只,处理组左眼注射重组人MANF10μg(3μl),右眼注射磷酸盐缓冲液(PBS)3μl,分别于注射后0.5 h、1 h、2 h及4 h四个时间点取材视网膜,每个时间点5只大鼠.新生大鼠视网膜分离培养原代Müller细胞,100ng/ml MANF处理细胞后,在不同时间点收集细胞Western blot检测磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达水平,冰冻切片免疫组化检测MANF诱导活化的磷酸化p44/42MAPK在视网膜上的定位.以Image J图像分析软件分析图像,Western blot条带密度比值和免疫荧光强度为计量资料以(-x±s)表示;各时间点与未处理组组间,采用独立样本t检验的方法进行比较.结果 SD大鼠玻璃体腔注射MANF后,磷酸化p44/42MAPK的表达在0.5 h就开始明显升高,1 h达到高峰,较对照玻璃体腔注射PBS组和未处理组差异均具有统计学意义(t=21.18,4.41;P<0.05),然后逐渐下降,4 h降至未处理组水平.冰冻切片免疫组化检查结果显示磷酸化p44/42MAPK阳性的细胞位于视网膜内核层的Müller细胞,其荧光强度显著高于阴性未处理组,差异有统计学意义(t=11.41,P<0.05).原代培养的Müller细胞经MANF处理后,磷酸化p44/42MAPK在5 min时较未处理组就有显著升高,差异有统计学意义(t=4.48,6.43;P<0.05),15 min达到高峰,差异有统计学意义(t=19.57,9.18;P<0.05),到30 min降至正常水平.结论 p44/42MAPK信号通路参与了MANF的神经保护作用机制.MANF直接作用于视网膜Müller细胞,可能通过与Müller细胞的相互作用起到细胞保护性作用.