沉默ILK基因的稳定转染细胞株的构建与鉴定

目的 研究整合素连接激酶(ILK)在细胞中的功能,构建ILK基因shRNA慢病毒载体,并对其在舌鳞癌细胞株Tca-8113中沉默效果进行鉴定.方法 针对ILK基因有效靶序列的3个位点,设计合成3对oligo DNA,退火形成双链DNA,与线性化pENTR/U6载体连接产生shILK-LV慢病毒载体,筛选出阳性克隆测序鉴定,用shILK-LV载体、包装质粒Packaging Mix共转染293T包装细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达数目测定病毒滴度并确定恰当的MOI值.获得重组慢病毒后感染人舌鳞癌细胞株Tca-8113,用qPCR及Western blot检测ILK在Tca-8113细胞中的表达.结果 测序证实成功构建了3个ILK-shRNA慢病毒载体,分别转染Tca-8113细胞后用sybr法检测出shRNA-ILK-370组ILK的表达明显下降,△△Ct值为0.268.用shRNA-ILK-370慢病毒栽体包装病毒,测定病毒滴度,并得出当MOI=30-60时,细胞阳性比率最高.用病毒感染Tca-8113细胞后再用抗生素筛选稳转株,后用qPCR检测干扰效率达90.5％,Western blot检测ILK表达明显被抑制.结论 成功构建shILK-LV慢病毒栽体并建立了稳定的Tca-8113-shILK细胞模型,为研究ILK在舌鳞癌信号转导通路中的作用提供了坚实基础.