带Flag标签的Sirt2真核表达载体的构建及其与PKM2的相互作用

目的 构建带Flag标签pcDNA3.0载体的沉默信息调节因子2(Sirt2)真核表达载体,验证其表达蛋白与M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相互结合.方法 利用聚合酶链反应(PCR)从人乳腺文库中扩增出人Sirt2的CDS编码序列,将扩增出的Sirt2基因片段插入双酶切后pcDNA3.0-Flag载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,验证表达,测序正确后,分别转染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共转染至人胚肾细胞(293T),通过免疫共沉淀实验证明Sirt2蛋白表与PKM2蛋白有相互结合.结果 重组质粒Flag-Sirt2的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;免疫共沉淀实验证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合.结论 成功构建了Flag-Sirt2真核表达载体,证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合,为进一步研究Sirt2在糖酵解中发挥的功能提供了基础.