人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体，利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段，补平后，插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体，构建pAdTrack－CMV－FⅦ，继而进行酶切和测序鉴定；经PmeⅠ单酶切线性化后，pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组，构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ；经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ，使用PEI试剂转染293 A细胞，包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ；利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平；通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定，FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中，获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ；将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组，成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ；在293A细胞内包装重组腺病毒，Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ，并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达，为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。