改良比格犬成肌细胞的体外分离纯化培养及其生物学特性研究

目的:建立一种体外分离、纯化、培养成年犬骨骼肌成肌细胞的简便有效方法,观察其生长增殖情况,并鉴定其生物学特征.方法:以成年比格犬为研究对象,采用机械分解法与Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶的二步酶消化法相结合分离获取犬成肌细胞,并采用差速贴壁法与免疫磁珠分选法相结合纯化成肌细胞.镜下观察分离纯化后的成肌细胞的细胞形态、生长状况,绘制细胞生长曲线,并采用流式细胞仪和免疫细胞化学等方法鉴定成肌细胞纯度.结果:原代培养6h后可见呈圆形的单核细胞贴壁生长,起初为小圆形,48 h后可见梭形贴壁细胞,3d后贴壁细胞明显增多,5d左右进入对数增长期,9d左右细胞单层融合接近90％.流式细胞仪检测纯化后的第4代(P4)成肌细胞显示,95％细胞表达CD56,Desmin免疫细胞化学染色显示细胞呈阳性反应.结论:该法可获取高纯度、高产量,具有良好增殖、分化能力的成肌细胞,并且获得的成肌细胞的生长增殖能力较强,符合半月板组织工程种子细胞的基本条件.