多巴胺D1受体Ala229Thr多态性对受体信号转导功能的影响

目的:构建表达不同基因型的人多巴胺D1受体(DRD1)真核细胞表达载体,明确DRD1Ala229Thr多态性对受体信号转导功能的影响.方法:从人基因组经PCR扩增DRD1基因编码区全长,将纯化后的PCR产物与pMD19-T载体进行T连接,得到DRD1229Ala(野生型)重组克隆载体.在野生型重组克隆栽体的基础上,应用定点突变方法构建229Thr(突变型)重组克隆载体.用Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切野生型和突变型重组克隆载体,将酶切后得到的目的片段纯化后与经相同双酶切的pcDNA3.1(+)表达载体连接,即得到野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1(+)重组真核细胞表达载体.将pcDNA3.1(+)空载体、野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1(+)重组真核细胞表达载体瞬时转染入COS-7细胞,用cAMP ELISA试剂盒分别检测forskolin和不同浓度多巴胺及(±)-SKF38393处理下细胞内基础cAMP的水平及激动剂诱导的cAMP的水平.结果:经双酶切及测序证实野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1(+)重组真核细胞表达载体构建正确.在forskolin处理的情况下,空载体组和阴性对照组细胞内cAMP的水平分别为(0.40±0.14)和(0.78 ±0.24) pmol/well,两者之间并没有显著差异(P=0.082),野生型组和突变型组细胞内cAMP的水平分别为(2.06±0.35)和(1.37±0.12) pmol/well,野生型组细胞内cAMP水平显著高于空载体组(P＜0.001)和突变型组(P=0.007);在多巴胺及SKF38393处理的情况下,细胞内cAMP的水平均呈浓度依赖性升高,但突变型组细胞内的cAMP水平均显著低于野生型组(P＜0.001).多巴胺的EC50值在野生型组为625 nmol/L,突变型组为9 612 nmol/L,比野生型组增加15倍;SKF38393的EC50值在野生型组为421 nmol/L,突变型组为417 nmol/L,两者之间不存在明显差异.结论:本研究成功构建了野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1(+)重组真核细胞表达载体;DRD1 Ala229Thr多态性影响受体的激活和信号转导功能,与野生型相比,229Thr型受体信号转导功能显著降低.