糖基化修饰对重组CTLA4-Ig稳定性影响的研究

目的:探讨糖基化修饰对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白稳定性的影响.方法:应用多种糖苷酶N-糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶F2(EndoF2)、唾液酸酶(neuraminidase)和O-糖苷酶(O-glycosidase)对样品进行处理.通过分子排阻色谱(SEC)测定不同酶切时间处理后样品纯度变化;应用差示扫描荧光(DSF)测定样品整体热力学参数的变化;应用差示扫描量热(DSC)测定样品各结构域热力学参数变化;在45℃条件下加热,分别于0、1、3、5、7、9、11和12周取样,通过SEC测定样品纯度的变化.结果:在N-糖苷酶F、内切糖苷酶F2和唾液酸酶分别处理过程中,CTLA4-Ig的聚体含量逐渐增加,而O-糖苷酶酶切过程中,聚体虽无明显变化,但碎片含量逐渐增加;经DSF测定,N-糖苷酶F和内切糖苷酶F2处理后解链温度(Tm)均明显下降,而唾液酸酶和O-糖苷酶处理后Tm无明显变化;经DSC测定,N-糖苷酶F和内切糖苷酶F2处理后Tm1下降,Tm2不变,Tm3上升,而唾液酸酶处理后Tm1和Tm3都略微有所上升,Tm2基本不变,O-糖苷酶处理后Tm值均变化;加速试验过程中,N-糖苷酶F和唾液酸酶处理样品的聚体上升,内切糖苷酶F2处理样品的的聚体不变;O-糖苷酶处理样品的的聚体不变,而碎片偏高.结论:通过多种分析手段研究发现,糖基化修饰与CTLA4-Ig的稳定性密切相关.