断裂内含肽C片段在大肠埃希菌表达系统中酶解稳定性的改良

断裂内含肽Npu DnaE介导的蛋白质剪接、剪切反应,可以应用于蛋白质工程领域诸多方面,但其C段重组蛋白在表达纯化过程中发生的降解,降低了重组蛋白的产率和纯度.为提高NpuC段稳定性,本研究构建了N端融合NpuN2片段的NpuC延长变体N2C.将N2C在BL21(DE3)中进行表达、用亲和色谱进行纯化,用ImageJ扫描计算表达纯化中降解情况,进而对影响内含肽C端剪切反应的各因素如温度、DTT浓度、N/C比例等进行了考察.结果表明,延长变体N2C使降解产物占比降低至2.7％～7.2％,在1 mmol/L DTT催化,N/C比例为5:1,37℃反应条件下,30 min产物生成率达90％.N2C在提升Npu DnaE内含肽C段在大肠埃希菌表达系统中表达、纯化过程的稳定性的同时,保留了其C端剪切反应的活性,对其在蛋白纯化领域应用有重要意义.