钙蛋白酶抑制剂calpeptin对丙烯酰胺所致神经丝磷酸化及相关激酶异常表达的拮抗作用

目的 通过制备神经干细胞(NSC)丙烯酰胺(ACR)中毒模型,探讨钙蛋白酶抑制剂calpeptin(CP)对ACR中毒的拮抗作用.方法 将新生24 h内Wistar乳大鼠的脊髓背根神经节(DRG)培养48 h制备原代NSC,用抗巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗,采用免疫荧光染色法鉴定.原代NSC培养至第4天,将其分为细胞对照组、CP组(CP 4μmol·L-1)、ACR染毒组(ACR 760μmol·L-1)和ACR+CP组(ACR 760μmol·L-1+CP 4μmol·L-1),培养48 h.采用Western蛋白印迹法检测NSC中蛋白激酶A(PKA),PKC和磷酸化高相对分子质量神经丝(p-NF-H)蛋白表达水平,应用免疫荧光法在荧光显微镜下观察PKA,PKC和p-NF-H蛋白在NSC中的分布和表达.结果 经免疫荧光染色法鉴定,制备的原代NSC巢蛋白免疫反应阳性,NSC纯度>90％;经维生素A诱导,该原代NSC可分化成NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞.Western蛋白印迹实验结果表明,与细胞对照组相比,CP组NSC中PKA,PKC和p-NF-H蛋白表达水平无明显变化;ACR组PKA和PKC蛋白表达分别下降41.6％和29.4％(P<0.05),p-NF-H蛋白表达升高66.4％(P<0.05).与ACR组相比,ACR+CP组PKA和PKC蛋白表达升高68.9％和34.4％(P<0.05),p-NF-H蛋白表达降低18.6％(P<0.05).免疫荧光法实验结果表明,与细胞对照组相比,CP组NSC中PKA,PKC和p-NF-H荧光强度相近,ACR组PKA和PKC荧光强度减少且分布不均匀,p-NF-H荧光强度增加;与ACR组相比,ACR+CP组NSC中PKA和PKC荧光强度升高且分布均匀,p-NF-H荧光强度减弱.结论 ACR可导致NSC中PKA和PKC蛋白表达降低,p-NF-H蛋白表达升高;CP对ACR导致的上述变化有拮抗作用.