人源KOR-GFP融合蛋白在昆虫细胞中的表达和活性鉴定

通过PCR方法扩增人源kappa型阿片受体基因(hKOR)和GFP基因,然后采用重叠延伸PCR(SOEPCR)将hKOR与GFP基因连接,并将融合基因通过无缝克隆技术克隆入pFastBac1载体,将筛选的阳性重组载体转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10αBac感受态细胞获得重组杆粒Bacmid-hKOR-GFP.采用重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,收获上清作为重组病毒P1代,采用流式细胞术检测病毒感染效率;采用Western blot 鉴定hKOR-GFP的表达情况;采用cAMP酶联免疫方法检测hKOR-GFP的功能活性.结果表明,采用感染复数(MOI)值为2,感染后72 h,hKOR-GFP在Sf9昆虫细胞中可达到高效表达;Western blot实验表明hKOR-GFP在昆虫细胞中获得正确表达;cAMP酶联免疫实验结果证明在激动剂存在下,Sf9细胞内cAMP含量出现剂量依赖性下降,表明hKOR-GFP具有生物活性.在昆虫细胞中高效表达具有功能活性的hKOR-GFP可为建立非成瘾性镇痛药物筛选技术平台奠定基础.