稳定高表达 RORα基因的人胃癌 MGC803细胞系的构建与鉴定

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达 RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究 RORα的功能奠定基础。方法根据 RORα基因的 cDNA 全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌 MGC803细胞中提取 mRNA 作为模板合成 RORα cDNA 第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体 pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌 DH5α；用氨苄青霉素筛选 pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒 pcDNA3.1(+)-RORα转染 MGC803细胞,G418筛选获得 RORα/MGC803细胞株；Real-time PCR 和 Western blot 检测该细胞株 RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体 pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1640 bp 的插入片段,与预期大小一致；表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与 RORα基因的 cDNA 序列完全一致。用构建的真核表达载体 pcDNA3.1(+)-RORα转染 MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的 RORα/ MGC803细胞株。 Real-time PCR 与 Western blot 检测显示,RORα/ MGC803细胞 RORα mRNA 和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体 pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达 RORα基因的 RORα/ MGC803细胞。