人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制.方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1 cDNA(3 878 bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1.通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定.同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达.结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3 878bp).重组质粒经HindⅢ-Not Ⅰ酶切后,得到3 878bp(PLCγ1基因)及6 100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约4300bp及约8 500bp两个片段,与预期一致.DNA测序也证实了重组质粒的正确.经RT-PCR和Western blot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞.结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础.