重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因的慢病毒载体.方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人IDO基因的全长编码区片段.将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞.对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析.重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;采用Wester blot检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度.结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml.结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础.