细胞角蛋白19基因的克隆构建与重组表达

目的:构建肿瘤标志物细胞角蛋白19(CK19)基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,以获取低成本、高产量、高纯度的CK19蛋白.方法:根据基因库CK19的基因序列,设计多条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增CK19基因,用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET28a中,PCR和DNA测序鉴定.将重组质粒CK19-pET28a转化大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,使用镍柱亲和层析纯化蛋白,并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定.结果:成功扩增出CK19基因片段,克隆到表达载体后经菌落PCR和DNA测序鉴定正确.重组质粒CK19-pET28a在大肠埃希菌中经诱导和纯化后获得纯度较高目的条带,蛋白质印迹结果证明目的蛋白有反应性.结论:成功构建了肿瘤标志物CK19原核表达载体,经过诱导表达和蛋白纯化获得了高纯度有活性的目的蛋白.