下调Ku70促进DDB1/2在双链断裂DNA聚集

目的 探讨DNA损伤结合蛋白DDB 1/2复合物在Ku70缺失的条件下与双链断裂DNA(double-strand breaks,DSB)亲和力的变化及下调DDB1对DSB修复的影响.方法 针对人类Ku70构建编码shRNA序列的重组腺病毒并感染细胞,建立Ku70蛋白表达沉默的细胞株,以博来霉素(bleomycin,Bleo)或新制癌菌素(neocarzinostatin,Ncs)诱导DNA双链断裂,利用DNA损伤修复蛋白与损伤染色质的高亲和力,分段提取细胞蛋白组分,Western blot检测DDB1/2在各组分的分布变化.免疫荧光检测诱导DNA双链断裂前后DDB1与损伤染色质亲和力的变化.沉默DDB1,Western blot检测在不同条件下γ-H2AX的去磷酸化效率.结果 人乳腺癌MDA-MB-231细胞Ku70蛋白水平在Ku70shRNA重组腺病毒感染后4d显著下调,6d达到最低.与Ku70正常细胞相比,在Ku70沉默后诱导DSB,Western blot检测结果显示DDB1/2主要分布在与染色质紧密结合的组分,免疫荧光同样表现出其与染色质亲和力增高.并且在Ku缺失的条件下,Western blot显示下调DDB1能显著降低γ-H2AX去磷酸化效率(P＜0.01).结论 下调Ku70可促进DDB1/2在双链断裂DNA聚集,且下调DDB1影响DSB修复,说明DDB1/2可能参与了不依赖于Ku的双链断裂的修复途径.