pET28 a-PTD-Ag85 B质粒构建及原核表达条件的优化

目的：构建pET28a-PTD-Ag85B原核表达载体，并对其在E．coli BL21（DE3）中表达条件进行优化。方法将TAT-PTD序列插入到用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切的pET28a质粒中，获得pET28a-PTD重组质粒；RT-PCR法扩增Ag85B基因并将其克隆至pET28a-PTD质粒中，获得pET28a-PTD-Ag85B重组质粒。将重组质粒pET28a-PTD-Ag85B转化至大肠杆菌，异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导PTD-Ag85B融合蛋白表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）鉴定表达产物。筛选最适诱导剂浓度、诱导温度和时间，尿素复性包涵体，并用His-tag离子亲和层析柱分离纯化融合蛋白。结果成功构建pET28a-PTD-Ag85B重组质粒，在E．coli BL21中能高效表达PTD-Ag85B融合蛋白。结论成功表达及纯化了PTD-Ag85B蛋白，为获得大量PTD-Ag85B融合蛋白提供了技术储备。