Bad真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建促凋亡基因Bad真核表达载体并鉴定其在人食管鳞癌细胞ECA109和KYSE450细胞中的表达.方法 设计Bad基因引物,通过PCR扩增获得其cDNA片段,经双酶切后,将此片段克隆至真核表达载体GV142中,转入DH5α,获得重组质粒GV142-Bad;PCR扩增、酶切及测序验证后,将其及对照空载体转染人食管鳞癌ECA109和KYSE450细胞,转染后24 h,通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光信号的表达情况,提取总RNA,使用qPCR检测Bad在转录水平的表达.结果 成功构建Bad真核表达载体,PCR扩增出长为545 bp的特异性片段,经克隆至真核表达载体GV142后酶切及测序鉴定准确.重组质粒GV142-Bad成功转染食管鳞癌细胞并在荧光倒置显微镜下观察到不同强度的绿色荧光信号.应用qPCR检测重组质粒GV142-Bad转染ECA109和KYSE450细胞的Bad基因mRNA表达水平上调,与空载体转染组和空白组比较差异有统计学意义 (P <0.05).结论 本研究成功构建Bad真核表达载体,用电转染法成功转染食管鳞癌ECA109和KYSE-450细胞,获得高表达并上调Bad基因mRNA的水平,为进一步研究Bad基因的功能奠定了基础.