DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体制备及感染结肠癌RKO细胞的干扰效应

目的 应用RNA干扰技术构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,感染结肠癌RKO细胞,观察其抑制DGKζ表达的效率.方法 运用Real-time PCR及Western blot检测8株结肠癌细胞中DGKζ基因的表达.针对DGKζ基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA oligo,慢病毒载体酶切,转染备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体.慢病毒感染RKO细胞后,运用Real time PCR和Western blot法检测DGKζ基因的敲减效率.结果 8株结肠癌细胞株中,DGKζ在RKO细胞中的表达丰度最高,满足敲减要求;测序表明重组质粒构建成功;Real-time PCR实验结果显示,在RKO细胞中,相对于感染慢病毒空载体细胞,DGKζ基因的敲减效率均达到70％以上(P＜0.05).Western blot结果显示,RKO细胞和感染慢病毒空载体细胞(Negative control)在124kDa处出现免疫印迹,而干扰敲减DGKζ基因的细胞(shRNA-DGKζ)则不表达内源性DGKζ蛋白,表明DGKζ基因慢病毒感染有很高的敲减效率.结论 成功构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,进一步证实了感染结肠癌RKO细胞的特异性干扰效应.