Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用

目的 构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作.方法 1)过表达载体的构建:本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2)ShRNA慢病毒表达载体的构建:根据shRNA的特征,设计shR-NA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中.3)慢病毒包装和滴度测定:将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定.结果 测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究.结论 利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用.