tumstatin基因修饰的CD34+造血干细胞生成抗血管生成活性的血小板

目的以慢病毒为基因载体,将tumstatin cDNA导入CD34+造血干细胞,在体外诱导生成tumstatin基因修饰的巨核细胞( MKs)和血小板,检测产生的血小板对血管内皮细胞管状结构形成的作用。方法构建 pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen重组载体后转染293T细胞进行病毒包装。用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法富集脐血中CD34+造血干细胞。用慢病毒感染CD34+造血干细胞,在细胞因子组合培养液中诱导MKs生成,流式细胞仪和形态学检测MKs的生成及产血小板情况。应用RT-PCR法和Western blot法检测tumstatin基因的表达,通过人脐静脉血管内皮细胞管状结构形成抑制试验研究血小板内容物生物学活性。结果选择最佳感染复数(MOI)30：1感染干细胞时效率最高；流式细胞术检测结果显示,细胞在诱导过程中,转染组与未转染组细胞都有MKs与血小板的生成,且生长速度和分化趋势基本相同。在转染的MKs基因组里,RT-PCR法检测到738 bp tumstatin基因片段。 Western blot法检测到tumstatin在转基因细胞来源的血小板中稳定表达,血小板可明显抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成。结论基因修饰的CD34+造血干细胞在体外成功诱导分化为MKs和血小板并表达tum-statin蛋白,且这种血小板在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成。