MANF对内质网应激诱导的细胞凋亡的保护作用

目的构建中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)基因真核表达质粒并转染小鼠神经瘤细胞系(N2A),建立稳定表达MANF的细胞系,并观察MANF对内质网(ER)应激诱导细胞凋亡的影响。方法将MANF基因克隆至pEGFP-C2载体中,经酶切、聚合酶链式反应(PCR)、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转染入N2A细胞,经 G418(500μg/ml)连续筛选,获得稳定表达MANF的神经细胞系。细胞免疫荧光法观察MANF的定位,蛋白质印迹法(Western blot)和反转录PCR法(RT-PCR)鉴定稳转细胞系中MANF的蛋白和基因表达水平。在稳定转染细胞系中,分别用4μg/ml衣霉素(TM)处理16 h和10μmol/L β淀粉样蛋白(Aβ)处理24 h诱导ER应激,Western blot法检测CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达和 Caspase-3的激活情况。结果构建的 pEGFP-C2-MANF质粒经酶切测序等鉴定确定构建成功,经G418抗性筛选出稳定转染 MANF 的 N2A 细胞系,RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光法证明稳转细胞中MANF的基因和蛋白水平均高表达,并且MANF的细胞定位准确。诱导ER应激后,MANF能显著抑制CHOP的表达和Caspase-3的激活。结论成功建立稳定表达MANF的神经细胞系,并且发现MANF可以抑制ER应激诱导的神经细胞凋亡。