人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的:构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)发生发展中的相关机制.方法:采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库.将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布.结果:提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接.将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库.在原始电转化菌稀释100倍后取10μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×106 CFU·mL-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×107 CFU.文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100％.结论:成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础.