NO信号通过I-kappaB磷酸化激活人肝细胞内源凝血因子Ⅷ重表达的调控作用

目的：建立一氧化氮（NO）前体化合物 L-精氨酸激活人肝细胞 L02内源凝血因子Ⅷ（FⅧ）重表达的分子细胞生物学模型，探讨 NO信号激活 L02中内源 FⅧ重表达的调控通路及分子基础。方法：取对数生长期 L02细胞随机分为对照组、加药组（L-精氨酸）、抑制剂组（L-NAME和 L-精氨酸）和抑制剂对照组（L-NAME），分别培养12、24、36、48和60 h，采用流式细胞术检测作用48 h后 L02中人 FⅧ蛋白的表达，Griess法检测不同时间点 L02细胞内 NO水平，RT-PCR法检测 L02中人 FⅧ基因、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因、核转录因子（NF-κB1）基因和核因子κB（免疫球蛋白κ轻链基因增强子）抑制蛋白α亚基（I-κB alpha）基因的转录水平， Western blotting法检测 L02中人磷酸化 I-kappaB（磷酸化 I-κB）表达水平。结果：流式细胞术检测，加 L-精氨酸培养48 h后L02中出现人FⅧ蛋白的表达。Griess法检测，加药组L02在3、6和12 h内NO表达水平显著增加（P＜0.05），随后又基本恢复到正常水平，正常组、抑制剂组和抑制剂对照组 L02细胞内 NO 水平无变化；RT-PCR检测，加药组 L02中人 FⅧ mRNA转录；对照组、抑制剂组和抑制剂对照组均无人 FⅧ mRNA的转录，加药组 iNOS、NF-κB1和 I-κB alpha转录水平均上升（P＜0.05），对照组、抑制剂组和抑制剂对照组上述基因转录水平均无明显变化。Western blotting 法检测，加入 L-精氨酸后，磷酸化 I-κB表达水平明显增加（P＜0.05），其他组则无此变化。结论：L-精氨酸通过 NO信号通路进而激活 I-κB磷酸化，导致人 FⅧ基因启动子上游调控相关的转录因子 NF-κB1进入胞核从而激活人离体肝细胞 L02中内源人 FⅧ的表达。