腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响

目的:构建蛋白酶体亚基α3(proteasome subunit alpha type 3,PSMA3)基因腺病毒重组载体,并观测腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响.方法:RT-PCR法扩增PSMA3基因全长CDs序列后,克隆入pTG19-T载体,再亚克隆入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,构建重组pAdTrack/PSMA3腺病毒载体,随后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组形成pAd/PSMA3重组腺病毒,经包装及滴度测定,获高感染力的pAd/PSMA3病毒.用pAd/PSMA3病毒感染人肝癌SMMC7721细胞,荧光显微镜观测被感染的SMMC7721细胞的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的变化情况.Cell counting kit-8(CCK-8)法检测pAd/PSMA3病毒对SMMC7721细胞增殖的影响.Real-time PCR和Westernblot分别检测被感染的SMMC7721细胞的PSMA3基因、增殖细胞核抗原基因(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase-3促凋亡基因及其编码蛋白的表达情况.流式细胞仪(FCM)检测被感染的SMMC7721的周期、凋亡变化.将经pAd/PSMA3病毒感染的SMMC7721细胞移植裸鼠皮下以生成荷瘤,逐日观察荷瘤的生长情况.所有实验以空病毒感染及未感染的细胞做对照.结果:克隆到768 bp的PSMA3基因,并构建了其具高感染力的pAd/PSMA3重组病毒.CCK-8法结果表明,过表达PSMA3基因的SMMC7721细胞,其增殖明显减慢(P＜0.05).Real-time PCR、Western blot检测显示,pAd/PSMA3重组病毒可介导SMMC7721细胞过表达PSMA3基因,上调其Caspase-3基因及其编码蛋白的表达,并下调其PCNA基因及其蛋白的表达(P＜0.05).FCM检测证实,过表达PSMA3基因的细胞可被阻滞于G1期(细胞周期),并可促使其凋亡,其凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05).动物实验证实,pAd/PSMA3病毒可明显抑制裸鼠荷瘤的生长(P＜0.01).结论:重组病毒pAd/PSMA3可将SMMC7721细胞阻滞于G1期(细胞周期),抑制其增殖,促使其凋亡,并可抑制其裸鼠荷瘤的生长,这些可能和下调其增殖相关PCNA蛋白,上调其凋亡相关caspase-3蛋白的表达密切相关.