铬还原酶T体外合成及活性鉴定

目的:克隆沙雷氏菌CQMUS2中铬还原酶T(Chromate reductase T,ChrT)的全基因,构建其原核表达载体并转化至大肠杆菌中表达蛋白,分析表达产物的活性.方法:应用PCR技术,以耐铬沙雷氏菌CQMUS2基因组DNA为模板扩增ChrT全基因,将该基因连接至表达载体pET-28a(+)并转化进大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21 (DE3)表达,用酶促反应鉴定重组ChrT酶的活性和Cr(Ⅵ)还原能力,探索其最适pH和温度.结果:克隆出的ChrT全基因长为567 bp,编码188个氨基酸,分子量约20 kD; IPTG诱导10 h后,在大肠杆菌中成功表达了目的蛋白,其碱基序列和分子量与ChrT酶一致;纯化后,ChrT酶能还原酶促反应体系中的Cr(Ⅵ),使实验组Cr(Ⅵ)含量明显低于对照组(P=0.000),其酶活可达997 U/L;ChrT酶的最适pH为6.5～7.5,最适温度为37 ℃.结论:ChrT酶具有Cr(Ⅵ)还原活性,为进一步研究高效除铬基因工程菌奠定了基础.