Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立

目的:构建携带let-7a基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤(Ewing's sarcoma,ES)细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a.方法:通过Gateway克隆技术,扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段,与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与母载体——pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应,生成目的质粒——pLV.Des2d.P/neo-EF 1A＞eGFP/let-7a;通过PCR及测序验证目的质粒;将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株A673和SK-ES-1获得A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞株;通过real-time PCR检测稳定转染细胞株内let-7a的表达水平,Western blot检测其靶基因CDK6的表达.结果:PCR证实获得的目的条带与理论值相符,测序分析证实携带let-7a的真核表达载体插入序列及位点正确;real-time PCR及Western blot检测结果显示,与转染空载质粒及未处理组的A673、SK-ES-1细胞株相比,稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a,分别达到8.5倍(P=0.000)和6.5倍(P=0.001),差异具有统计学意义;且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少.结论:成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a.