SIRT7基因乙酰化活性缺失突变真核表达载体的构建

目的：构建SIRT7基因乙酰化活性缺失的定点突变真核表达载体。方法用RT‐PCR法从293T细胞中扩增SIRT7基因，并克隆到真核载体 pcDNA 31．／myc‐His（－）A上。采用 Two‐step PCR定点突变技术，构建SIRT7基因的 H187Y突变质粒，经测序确证定点突变成功，再将SIRT7及突变载体转染293T细胞，Western blot检测融合蛋白表达。结果克隆出SIRT7基因，构建了真核载体pcDNA 31．／myc‐His‐SIRT7，经 Two‐step PCR获得突变体pcDNA 31．／myc‐His‐SIRT7H187Y。DNA测序结果表明，编码187位氨基酸的560～562位碱基由CAC突变为TAC ，其他碱基均无突变。SIRT7和 H187Y突变载体转染293T 细胞后，可检测出myc‐SIRT7融合蛋白表达。结论成功构建了SIRT7以及 H187Y突变的真核表达载体。