socs3基因3'端非翻译区野生型与突变型载体的构建及活性鉴定

目的 研究非编码小RNA-1896(miRNA-1896)和miRNA-409-3p对细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,socs3)基因的调控作用,构建socs3基因3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)野生型和突变型重组荧光素酶报告载体.方法 以原代培养的小鼠星形胶质细胞总cDNA为模板,通过点突变和缺失突变的方式分别对socs3 3'-UTR序列中miRNA-1896和miRNA-409-3p种子区的结合位点CAGAGA(897～902位)和AACATT(1425～1430位)进行突变,并将野生型的3'-UTR序列与突变的3'-UTR序列分别插入到虫荧光素酶表达质粒pGL3-Promoter获得重组质粒,命名为pGL3-SOCS3-WT、pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2.将上述重组质粒分别与miRNA-1896和miRNA-409-3p共转染至HEK293T细胞中,测定虫荧光素酶的活性.结果 酶切验证及测序结果表明,重组质粒pGL3-SOCS3-WT、pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2构建成功.与对照组相比,转染miRNA-1896和miRNA-409-3p均显著降低了pGL3-SOCS3-WT虫荧光素酶的活性,但对pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2荧光素酶的活性并无明显影响.结论 成功构建了socs3 3'-UTR野生型及突变型的虫荧光素酶重组表达质粒,确认CAGAGA(897 ～ 902位)和AACATT(1425～1430位)分别是miRNA-1896和miRNA-409-3p种子区与socs3 3'-UTR结合的关键位点.