OC-STAMP基因过表达载体及稳转细胞系的构建

目的 构建破骨细胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)基因过表达质粒,体外转染RAW264.7细胞构建稳转细胞系,为进一步研究OC-STAMP的功能提供工具.方法 根据NCBI数据库中OC-STAMP基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并将其克隆至含有绿色荧光蛋白(GFP)的pCDH-CMV慢病毒载体,经酶切测序对重组质粒进行鉴定;转染成功构建的质粒至293T细胞中Western blotting验证蛋白过表达情况;采用psPAX2和pMD2.G两种包装质粒包装pCDH-CMV-oc-stamp重组质粒获得病毒液,病毒感染RAW264.7细胞获得OC-STAMP过表达稳转细胞系,Q-PCR和Western blotting验证蛋白过表达情况.结果 酶切和测序鉴定表明成功构建pCDH-CMV-oc-stamp的基因重组质粒;将成功构建的pCDH-CMV-oc-stamp质粒转染至293T,可观察到大量绿色荧光表达;将成功包装获得的病毒液感染RAW264.7细胞后q-PCR及Western blotting结果证实OC-STAMP成功过表达.结论 成功构建pCDH-CMV-oc-stamp重组质粒及OC-STAMP过表达的稳转细胞系.