人锌转运体8嵌合抗原受体表达载体的构建与初步应用

目的:构建人锌转运体8 (zinc transporter 8,ZnT8)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的慢病毒表达载体,为研究抗原特异性调节性T细胞(regulatoryT cells,Tregs)在1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)自身免疫中的调节作用提供实验基础.方法:通过分子克隆及基因重组技术构建PLVX-EGFP-ZnT8scfv慢病毒表达载体质粒,并制备ZnT8scfv-CAR慢病毒;利用ZnT8 scfv-CAR慢病毒感染Tregs,流式细胞术检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达确定慢病毒感染效率;细胞计数评估Tregs细胞增殖能力;流式细胞术检测增殖细胞中CD4、CD25、Foxp3和Helios的表达.结果:酶切鉴定和基因测序结果显示PLVX-EGFP-ZnT8 scfv慢病毒表达载体构建成功;质粒共转染293T细胞后制备浓缩慢病毒滴度为2.4×108 TU/μL;ZnT8 scfv-CAR慢病毒转染Tregs后GFP表达率为43.2％±4.1％;体外培养14d后ZnT8特异性Tregs增殖(634.3±92.5)倍,且高表达Foxp3(60.4％±3.5％)和Helios(64.3％±4.8％).结论:成功构建了包含CAR结构的PLVX-EGFP-ZnT8scfv慢病毒载体并包被ZnT8 scfv-CAR慢病毒;慢病毒转染后的CAR-Tregs体外扩增14 d仍能够维持ZnT8-CAR结构表达;CAR-Tregs为一群CD4+CD25+细胞且高表达Foxp3和Helios.