小鼠Krüppel样因子4RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠Krüppel样因子4 RNA干扰慢病毒表达载体,并观察KLF4基因在小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达情况.[方法]根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,合成、制备KLF4-shRNA DNA片段,与载体连接构建真核表达慢病毒干扰载体pLVX-KLF4-shRNA,转化感受态,筛选阳性克隆,并进行测序鉴定.在Lipofectamine(R)3000的介导下,pLVX-KLF4-shRNA1/2与psPAX2、pMD2.G辅助质粒共转染293T细胞,包装产生病毒Lenti-KLF4 1/2,将重组的慢病毒感染RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测KLF4 mRNA的表达.收集病毒上清并浓缩测定病毒滴度.[结果]经测序证实,沉默小鼠KLF4基因的真核表达慢病毒干扰载体构建成功,倒置荧光显微镜下可见包装细胞293T细胞表达绿色荧光,RT-PCR证实RAW264.7细胞中KLF4 mRNA的敲除效率分别在60％、75％左右(P＜0.05).初次浓缩后测定小鼠KLF4基因重组慢病毒的滴度为1.65×108 TU/ml.[结论]成功构建出KLF4的RNA干扰慢病毒载体pLVX-KLF4-shRNA 2可用,并包装出慢病毒,为本实验在后续的体内体外研究中探讨KLF4的作用机制奠定了实验基础.