小鼠盐皮质激素受体基因shRNA慢病毒干扰系统的建立与鉴定

[目的]应用RNA干扰技术,构建小鼠盐皮质激素受体(mineralcorticoid receptor,MR)基因重组慢病毒载体并鉴定.[方法]根据本室已经筛选的有效RNA干扰序列和阴性对照序列,合成单链引物并经退火形成双链寡核苷酸序列,连接经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,提取质粒DNA并经测序验证.测序正确后,在Lipofectamine@3000的介导下,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2 、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清经浓缩后感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术评价其滴度及感染复数,实时定量PCR法鉴定MR shRNA慢病毒的干扰效率.[结果]成功构建了重组质粒pLVX-shRNA-MR,经DNA测序验证载体构建成功.流式细胞术测定重组慢病毒的感染复数大约为100,实时定量PCR法和Western Blot法检测干扰效率大约为75％左右.[结论]成功构建出小鼠MR基因shRNA慢病毒干扰系统.