钠泵α2亚基介导低浓度哇巴因影响大鼠心室肌细胞收缩力的作用研究

背景 强心苷类(CGs)药物临床治疗心力衰竭因其治疗窗窄使应用受到很大限制.心肌钠泵是CGs药物作用的靶点,然而CGs药物与钠泵相互作用的机制仍有待阐明.目前认为,钠泵的第一个膜外区H1-H2是哇巴因可能的结合位点.目的 利用作用在抗心肌钠泵以亚基H1-H2膜外区结构域的多克隆WJS为工具,封闭该结合位点,有效拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用,比较封闭前后哇巴因对心室肌细胞钠泵活性的影响及心室肌细胞收缩力、细胞内钙的变化,探讨钠泵与哇巴因的作用机制.方法 2013年1月-2015年1月急性分离大鼠心室肌细胞,将心室肌细胞分为4组,1 μmol/L哇巴因组、WJS+1μmol/L哇巴因组、1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组.1 μmol/L哇巴因组给予哇巴因(1μmol/L)进行灌流;WJS+1μmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5h后,再给予哇巴因(1μmol/L)进行灌流;1 mmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流;WJS+1 mmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5h后,再给予哇巴因(1mmol/L)进行灌流.采用全细胞膜片钳技术记录钠泵电流(Ip),观察WJS对哇巴因抑制Ip作用的影响;采用激光共聚焦显微镜测定心室肌细胞游离钙浓度([Ca2+]i);采用细胞动缘探测系统测定心室肌细胞收缩力的大小.结果 Western blotting法检测结果显示,纯化后的WJS在电泳时分别出现2条清晰的条带,其分子量均为110 kD左右.细胞免疫荧光法测定结果显示,WJS均结合在心室肌细胞钠泵的膜外区,而且这种结合并不被1μmol/L哇巴因影响,但却被在H1-H2膜外区特异性抗原点具有相同成分的多肽阻断剂RE2取消.WJS+1μmol/L哇巴因组高亲和力钠泵电流(Iph)低于1μmol/L哇巴因组(P＜0.05);1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组Iph高于1μmol/L哇巴因组和WJS+1μmol/L哇巴因组,低亲和力钠泵电流(Ipl)低于1μmol/L哇巴因组和WJS+1μmol/L哇巴因组(P＜0.05);WJS+1 mmol/L哇巴因组Iph高于1 mmol/L哇巴因组,Ipl低于1 mmol/L哇巴因组(P＜0.05).灌流5、15 min WJS+1μmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i低于1 μmol/L哇巴因组(P＜0.05);灌流5、15 min 1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1μmol/L哇巴因组(P＜0.05);灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i高于1 mmol/L哇巴因组(P＜0.05).灌流5、15 min WJS+1μmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力低于1 μmol/L哇巴因组(P＜0.05);灌流5 min 1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1iμmol/L哇巴因组,灌流15 min心室肌细胞收缩力低于1μmol/L哇巴因组和WJS+1μmol/L哇巴因组(P＜0.05);灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力低于1 mmol/L哇巴因组(P＜0.05).结论 抗心肌钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域的多克隆抗体WJS取消Iph和低浓度哇巴因所致的心室肌细胞收缩力增强作用,表明钠泵α2亚基介导低浓度哇巴因治疗心力衰竭的作用.