shRNA-SIVA1慢病毒载体的构建及其对胃癌细胞耐药性的影响

目的 构建shRNA-SIVA1慢病毒表达载体,研究其对胃癌SGC-7901/DDP细胞耐药性和增殖的影响以及可能的机制.方法 根据GenBank数据库提供的SIVA1基因序列,设计3条SIVA1靶点干扰序列;引物退火形成双链DNA,与经过双酶切的线性化GV493载体连接并转化;在293T细胞中进行病毒包装并测定病毒滴度;将重组慢病毒转染人胃癌SGC-7901/DDP细胞,qRT-PCR和Western blot检测细胞SIVA1 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞对顺铂(DDP)的敏感性变化以及细胞增殖的情况,Western blot检测细胞Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达情况.结果 测序结果显示,设计的干扰序列正确插入GV493载体,成功构建shRNA-SIVA1重组载体;慢病毒载体在293T细胞完成包装,病毒滴度为2×109 TU/mL;qRT-PCR和Western blot结果显示,慢病毒载体转染SGC-7901/DDP细胞后,能显著降低SIVA-1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.005);CCK-8实验结果显示,沉默SIVA1后,细胞对DDP的敏感性显著下降(P<0.005),同时细胞的增殖活性显著升高(P<0.01),并且凋亡抑制分子Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达增加.结论 成功构建了靶向人SIVA1基因的shRNA-SIVA1慢病毒表达载体,干扰胃癌细胞的SIVA1表达可增强细胞对DDP的抵抗并促进细胞增殖活性,这一现象可能与凋亡抑制分子Bcl-2和Bcl-xL的表达升高有关.