NLRP3基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及miR-22-3p靶向调控

目的 构建核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-contai-ning protein 3,NLRP3)基因3′非编码区(untranslated region,UTR)野生型及突变型双荧光素酶报告质粒载体,分析微小RNA(miR)-22-3p对NLRP3的调控作用.方法 应用生物信息软件预测miR-22-3p与NL-RP3基因的结合位点;将NLRP3基因的3′UTR序列及其突变体克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK2中,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及基因测序方法鉴定载体是否构建成功;将培养的人胚肾293T细胞(HEK293T)分为4组:(1)miR-22-3p对照+psiCHECK2;(2)miR-22-3p对照+psiCHECK2-NLRP3-3′UTR(野生型);(3)miR-22-3p模拟物(mimic)+psiCHECK2-NLRP3-3′UTR(野生型);(4)miR-22-3p模拟物(mimic)+psiCHECK2-NLRP3-3′UTRmut(突变型),分别检测细胞荧光素酶活性.结果 成功构建了NLRP3基因3′UTR野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体;NLRP3-3′UTR野生型与miR-22-3p mimic共转染293T细胞后,荧光素酶活性降低,下降43％,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建NLRP3基因3′UTR双荧光素酶报告质粒载体并初步验证miR-22-3p对NLRP3的调控作用.