重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建的实验研究

目的 本研究旨在构建并制备增强型荧光蛋白(EGFP)基因和Klotho基因重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho,并将其感染HEK293细胞,为基因治疗提供研究基础.方法 设计含有NheⅠ与NotⅠ双酶切位点的引物,应用PCR方法扩增Klotho基因,将其连接到EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho,利用Polyfectin脂质体将骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293细胞进行同源重组,得到重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho,并包装扩增,测定病毒颗粒数及滴度.采用PCR方法对重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho进行鉴定,并进行Klotho基因测序.结果 经PCR和NheⅠ、Not I双酶切鉴定,重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho中证实含有Klotho基因,测序结果和设计序列比对一致,重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建成功.滴度为2.0×1010Tu/mL,成功感染HEK293细胞,感染复数(MOI)=100,感染效率达91.75％,从Ad-EGFP-Klotho重组腺病毒载体中可以检测到3 045 bp的条带,表明目的基因已成功整合在重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho基因组中.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含有EGFP和Klotho基因的重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho,制备获得高滴度的病毒,可高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白.