慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体，并将之转染至293T细胞，通过RNA干扰致使p66shc基因沉默，为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点，命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3，与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接，转化入感受态的DH5α细胞，挑取阳性克隆测序正确后，与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞，于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达，证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达，选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点，为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内，通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体，转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。