稳定转染ABCG2 shRNA真核沉默载体的人喉癌Hep-2细胞的建立及其SP检测

目的：构建ABCG2 shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株探讨ABCG2基因表达与Hep-2细胞中SP（侧群细胞）比例的关系。方法（1）利用脂质体法转染ABCG2 shRNA真核沉默载体，嘌呤霉素筛选阳性转染细胞克隆，制备稳定转染shRNA真核沉默载体的 Hep-2细胞系，用RT-PCR、Western-blot及免疫荧光法检测转染效率及ABCG2沉默效果。（2）Hep-2及Hep-2-shABCG2稳转细胞经Hoechest33342以及维拉帕米和PI染色后，流式细胞仪检测转染后各组细胞中SP比例的变化。结果（1）荧光显微镜检测在sh-ABCG2组和Sh-Con组的Hep-2细胞中可以清楚看到绿色荧光表达，细胞形态清晰可见；未转染组未见绿色荧光；（2）嘌呤霉素的筛选浓度：细胞培养到2周时观察到最佳筛选浓度确定为1．0 mg·L-1，维持浓度为0．5 mg ·L-1；（3）RT-PCR结果显示，Hep-2细胞稳定转染shABCG2后，ABCG2表达量显著降低；而转染空载体组与未转染组ABCG2表达无明显差异；（4）Western-blot结果显示，稳转细胞Hep-2- shABCG2未检测到ABCG2蛋白表达；而空载体转染组与未转染组均可见ABCG2表达，且无明显差异（P＜0．01）；（5）FACS检测结果显示，与Sh-con组和未转染组相比较，shABCG2稳定转染组SP细胞比例明显降低（P＜0．01）。结论（1）成功建立ABCG2 shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株；（2）ABCG2基因表达与SP细胞比例密切相关。