铜绿假单胞菌群体感应相关sRNA的筛选及突变株的构建

目的 群体感应与调控小RNA(small regulatory RNA,sRNA)在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)许多信号传导级联反应中起关键调节作用.文中旨在探讨sRNA是否参与P.aeruginosa的群体感应表达调控系统,筛选群体感应系统相关sRNA,构建sRNA过表达与敲除株.方法 利用基因转录组测序及qPCR筛选群体感应系统相关sRNA;利用PCR扩增目的基因,使用无缝连接试剂盒将线性化载体与目的片段连接,分别将pROp200-sRNA和pGSM-△sRNA的连接反应液转化入E.coliDH5α和SM10λπ感受态细胞中,通过 PCR鉴定重组载体;将过表达质粒 pROp200-sRNA 转化入铜绿假单胞菌野生株PAO1,获得PAO1-sRNA过表达株;通过接合反应将pGSM-△sRNA转移至PAO1,获得PAO1△sRNA敲除株.对处于对数生长期的PAO1野生株、PAO1-sRNA过表达株、PAO1△sRNA敲除株及PAO1△sRNA/sRNA过表达株提取RNA,逆转录,验证sRNA基因过表达株及敲除株.绘制各菌株生长曲线,检测绿脓素的浓度.结果 成功利用转录组测序及qPCR筛选出群体感应相关sRNA P26、P5316.1、P30、P34、AmiL.pROp200经过EcoRI酶切后,质粒由超螺旋结构变为线性结构;pGSM-MR经SacI、XbaI双酶切后,产生长度分别为1898bp和7509bp的片段.PAO1-sRNA过表达株的sRNA基因表达量均较PAO1野生株显著上调(P<0.05);PAO1△sRNA敲除株的sRNA基因表达量较PAO1野生株均明显降低(P<0.05);PAO1△sRNA/sRNA过表达株的sRNA基因表达量较PAO1△sRNA敲除株均明显升高(P<0.05).绿脓素检测显示,PAO1-sRNA过表达株AmiL绿脓素浓度低于PAO1野生株[(1.73±0.03)μg/mL vs(2.83± 0.09)μg/mL,P<0.05],PAO1△sRNA/sRNA过表达株AmiL绿脓素浓度较PAO1△sRNA敲除株降低(P<0.05),P30绿脓素浓度较PAO1△sRNA敲除株升高(P<0.05).结论 PAO1-sRNA过表达株与PAO1△sRNA敲除株构建成功,可用于研究sRNA与群体感应系统间的调控关系,并进一步功能研究.