慢病毒载体对MDA-MB-231细胞中microRNA-18a-3P表达的影响

目的 构建人microRNA-18a-3P(miR-18a-3P)过表达及干扰慢病毒载体,研究病毒感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的步骤和方法 .方法 PCR技术扩增相应目的基因片段并进行酶切,回收后与目的基因连接,产物转化细菌感受态细胞,对阳性克隆测序行对比分析,构建miR-18a-3P过表达及干扰慢病毒载体,荧光法测定病毒滴定;倒置荧光显微镜观察人乳腺癌细胞MDA-MB-231转染及筛选过程的转染效率,筛选最佳MOI值;qRT-PCR检测慢病毒转染后MDA-MB-231细胞内miR-18a-3P的表达.结果 测序分析证实重组慢病毒构建正确;过表达及干扰慢病毒滴度分别为2×109和1×109 TU/ml;加Polybrene较未加Polybrene转染效率升高,当感染复数为10 TU/ml,Polybrene浓度为1μg/ml时,转染效率最佳;miR-18a-3P转染组过表达miR-18a-3P的相对表达量较空白对照组、阴性对照组高(P<0.05),miR-18a-3P转染组干扰表达miR-18a-3P的相对表达量较空白对照组、阴性对照组低(P<0.05).结论 成功构建了miR-18a-3P过表达及干扰慢病毒表达载体,对人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行转染和筛选后,可快速高效率获得所需目的细胞.