乙肝病毒S基因Pre-S区突变的人肝癌细胞HepG2稳定株构建及其生物学行为变化

目的 构建稳定过表达乙肝病毒 (HBV) S基因Pre-S区突变 (Pre-S1缺失突变、Pre-S2缺失突变) 的HepG2细胞株, 并观察该突变对HepG2细胞生物学行为的影响.方法 以NCBI中HBV JX661479. 1的Pre-S/S片段序列信息为模板, 设计并确定Pre-S1突变、Pre-S2突变的核苷酸序列, 采用全基因合成法获得目的片段并定向导入带有FLAG标签的p LVX慢病毒质粒载体 (p Lenti-CMV-3FLAG-PGK-Puro) , PCR、双酶切、Sanger测序技术检测重组质粒中目的片段的准确性.将HepG2细胞随机分为5组, 空白对照组不处理, p LVX-vector组、野生型组、Pre-S1突变组、Pre-S2突变组分别感染p LVX-vector、p LVX-Pre-S/S、p LVX-Pre-S1 mut/S、p LVX-Pre-S2 mut/S慢病毒液;利用嘌呤霉素筛选HepG2稳定株, 采用Western blotting法鉴定目的蛋白, 分别采用克隆形成、细胞划痕试验观察HepG2细胞稳定株增殖、迁移能力.结果 构建的p LVX-Pre-S/S、p LVX-Pre-S1 mut/S、p LVX-Pre-S2 mut/S重组表达质粒PCR电泳产物与理论值相符, 经EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切后电泳产物与理论值相符; Sanger测序结果显示, p LVXPre-S1 mut/S、p LVX-Pre-S2 mut/S突变型除突变序列外, 其他序列与HBV S基因野生型序列完全相同.空白对照组HepG2细胞全部死亡, 其余组HepG2细胞部分存活.在野生型组、Pre-S1突变组、Pre-S2突变组43 k D分子量位置检测到目的条带表达, 而p LVX-vector组无法检测到相应条带.与其他组比较, Pre-S2突变组HepG2的第14天克隆形成数增多、细胞相对迁移距离增大 (P均<0. 05) .结论 成功构建了HBV Pre-S/S基因野生型及Pre-S突变型的HepG2细胞稳定株, HBV的S基因Pre-S2缺失突变导致肝癌HepG2细胞增殖及迁移能力增强.