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CRISPR/Cas9基因编辑技术构建5型磷酸二酯酶基因敲除鼠的模型及表型分析

China Medicine(2020)

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Abstract
目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立5型磷酸二酯酶(PDE5)基因敲除小鼠模型并分析小鼠表型,初步探讨PDE5基因敲除对小鼠各项生命指标的影响.方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过胚胎显微注射移植法引导Cas9裂解酶裂解PDE5基因,删除第2外显子589个核苷酸构建敲除小鼠模型,鼠尾DNA做聚合酶链反应和测序鉴定基因型,将阳性PDF5基因敲除鼠和C57BL/6J背景鼠回交,再次通过鼠尾DNA做聚合酶链反应和测序鉴定基因型验证阳性PDE5敲除鼠并繁育.选择8只雄性C57BL/6J野生型小鼠及8只雄性PDE5基因敲除纯合子小鼠,通过观察2组小鼠生长发育情况,利用病理切片和超声心动图检测心脏结构和功能,检测全血细胞计数和生化指标,进行开场实验,分析PDE5基因敲除小鼠的表型.结果 PDE5基因敲除小鼠已成功繁育鉴定,子代基因敲除纯合型小鼠无胚胎期致死现象且生长正常,与野生型小鼠相比外观、生长发育未见明显差异.PDE5基因敲除对小鼠的心脏形态及功能无明显影响;但基因敲除鼠的血小板计数、中性粒细胞计数及百分比均明显低于野生鼠[(894±74)×109/L比(1 052±150)×109/L、(1.3±0.4)×109/L比(1.8 ±0.4)×109/L、(14±3)%比(18±4)%](均P<0.05).同时,基因敲除鼠开场实验中0~5 min和5~ 10 min的全场运动距离和全场运动速度明显高于野生鼠[全场运动距离:(18 345 ±5 480) mm比(12 057±3 154)mm、(15 249±3 581)mm比(10 190±1 869)mm;全场运动速度:(61±18)mm/s比(40±11)mm/s、(51±12) mm/s比(34±6)mm/s](均P<0.05).结论 经基因型鉴定已成功获得PDE5基因敲除小鼠.表型分析提示,PDE5基因敲除鼠较野生鼠而言,血小板和中性粒细胞水平降低,活动力明显增强,但PDE5基因敲除对小鼠心脏形态及功能未见明显影响.
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