Klotho对缺血再灌注急性肾损伤的影响研究

目的 探讨基因Klotho对缺血再灌注急性肾损伤的影响及可能的作用机制.方法 60只BALB/c小鼠按随机数字表法分为假手术+0.9％氯化钠注射液组(Sham+veh组)、假手术+Klotho补充组(Sham+kl组)、缺血再灌注急性肾损伤+0.9％氯化钠注射液组(I/R+veh组)、缺血再灌注急性肾损伤+Klotho补充组(I/R+kl组),每组各15只.各组小鼠再按不同的处死时相(术后第1、2、7天)随机分为D1(5只)、D2(5只)、D7(5只)3个亚组.采用双侧肾蒂夹闭法建立缺血再灌注急性肾损伤模型.Sham+veh组和Sham+kl组小鼠定位肾蒂但不夹闭,其余操作同上.Sham+kl组和I/R+kl组予再灌注后30 min腹腔注射360 ng Klotho蛋白注射液,Sham+veh组和I/R+veh组腹腔注射0.2ml 0.9％氯化钠注射液.于造模术后第1、2、7天收集小鼠血、尿、肾脏标本.分别检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)值,HE染色观察肾小管损伤程度,免疫组化法观察肾脏组织炎症细胞浸润情况及Klotho表达情况,ELISA法检测血Klotho和尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平,real-time PCR及Western blot法分别检测肾脏组织Klotho、凋亡相关因子B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、裂解的半胱氨酸蛋白酶(cleaved Caspase)-3的mRNA及蛋白表达.结果 I/R+veh组小鼠遭受缺血再灌注损伤后肾功能显著下降,肾小管上皮细胞变性、坏死,至术后第7天明显好转.与Sham+veh组比较,I/R+veh组小鼠血Klotho蛋白水平于术后第1天明显降低,至术后第7天仍未能恢复正常,肾脏组织Klotho mRNA及蛋白表达水平于术后第1天同样明显降低(均P<0.05).I/R+veh组小鼠肾脏组织Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白、cleaved Caspase-3蛋白表达水平均于术后第1天较Sham+veh组明显升高(均P<0.05),CD68+细胞浸润增多.外源性补充Klotho蛋白后,I/R+kl组肾脏组织Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白、cleaved Caspase-3蛋白表达水平分别较I/R+veh组下降30％、45％、62％(均P<0.05),CD68+细胞浸润减少.结论 缺血再灌注急性肾损伤时Klotho表达下调;外源性补充Klotho蛋白可能通过抑制细胞凋亡及炎症细胞浸润等途径发挥肾脏保护作用.