MLH1 R217C/BRAF V600E突变型家族性甲状腺乳头状癌永生化细胞系的建立及鉴定

目的：建立家族性甲状腺乳头状癌（FPTC）永生化细胞系，为研究家族性非髓样甲状腺癌（FNMTC）提供新的途径。方法选取FPTC患者的肿瘤标本，采用消化法分离原代细胞。使用改良的DMEM/F12培养基，添加促甲状腺激素（TSH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、表皮细胞生长因子（EGF）及氢化可的松等进行培养。在原代细胞早期分2种方式导入外源基因SV40T/TERT用于诱导永生化。利用RT-PCR检测甲状腺过氧化物酶（TPO）、甲状腺球蛋白（TG）、促甲状腺激素受体（TSHR）、钠/碘共同转运体（NIS）等基因的表达，同时利用免疫荧光技术检测TPO及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）蛋白的表达。提取该患者外周血DNA，进行突变基因的检测。提取细胞基因组PCR扩增后测序，进行突变基因的检测。结果分离的FPTC原代细胞呈梭形或不规则多角形贴壁生长；细胞生长6个月，转染SV40T组（标记为FPTC-S）传代至p26，FPTC细胞传代至p23，转染SV40T+hTERT组（标记为FPTC-ST）传代至p19，细胞增殖能力较好；FPTC-S与FPTC-ST细胞均能够在基因水平稳定表达TPO、TG与TSHR；患者外周血中存在MLH1 R217C胚系突变；原代细胞存在BRAF V600E突变；原代细胞及永生化的细胞系中均存在MLH1 R217基因突变。结论本研究初步建立了FPTC永生化细胞系，且该细胞系中存在MLH1 R217C及BRAF V600E突变，该细胞系将为研究以上突变及其相互作用关系提供研究模型。