免疫荧光检测p53与线粒体共定位的实验方法探索

目的 探索研究p53与线粒体共定位的最佳免疫荧光条件,为检测蛋白质与线粒体共定位的研究提供参考.方法 低氧处理HeLa细胞,免疫印迹检测p53表达;分别使用甲醇固定HeLa细胞、甲醇:丙酮混合液(体积比1:1)固定HeLa细胞、4％多聚甲醛固定HeLa细胞,前二者不作通透处理,后者用0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X 100)通透,同时染色p53和线粒体;用4％多聚甲醛固定HeLa细胞后,降低Triton-X 100浓度至0.05％、0.025％、0.01％和0.005％,同时染色p53和线粒体;用4％多聚甲醛固定HeLa细胞后,Triton-X 100浓度降至0.01％和0.005％,通透标记p53后再次使用0.1％ Triton-X 100重新通透细胞器膜染色线粒体.结果 低氧后p53表达上调(P＜0.01),可用于后续免疫荧光实验.使用甲醇和混合液固定组均可同时在细胞核及细胞质内观察到明显的p53信号,并可观测到其与线粒体的共定位,混合液组共定位更明显.多聚甲醛固定组用0.1％Triton-X 100通透后p53信号主要在细胞核内,未能观察到共定位;使用4％多聚甲醛固定后,降低Triton-X 100浓度至0.05％和0.025％在一定程度上削弱p53核内信号,增强共定位信号,但细胞核内信号仍强于细胞质,当降低至0.01％和0.005％,细胞质内检测到p53信号,细胞核内未检测到p53信号,提示此条件下核膜未被通透,但同样也未能通透线粒体膜,导致线粒体标记失败;二次通透完全规避p53核内信号,并成功标记线粒体,检测到p53与线粒体的共定位.结论 使用甲醇或混合液固定可观察到p53与线粒体共定位,其中混合液效果更佳;使用4％多聚甲醛固定结合2次通透可有效避免核内信号,检测到p53和线粒体的共定位.