酶切法去除荧光定量聚合酶链反应体系中内源性核酸污染

目的 建立去除荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)体系中内源性核酸污染的方法,用于降低或排除颅内术后易感染细菌的荧光定量PCR检测出假阳性的概率.方法 首先去除荧光定量PCR反应体系中的内源性核酸污染;随后利用多重PCR技术,以混合菌DNA作为模板进行革兰菌特异性鉴定;并研究去除污染后的多重PCR技术检测混合细菌DNA的检测限和灵敏度.结果 建立的方法能够快速有效地去除荧光定量PCR体系内的内源性核酸污染,并对PCR体系中Taq酶的活性以及扩增效率均无影响,最低检测限为102 CFU/mL(金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌),与培养法相同.酶切法对PCR体系中酶的活性及扩增效率均无明显影响,且对PCR反应体系及引物特异性没有影响(循环数Ct=32,荧光强度ARn=200).过滤法却使PCR扩增效率显著下降(循环数Ct=32,荧光强度ΔRn=150).结论 酶切法去除内源性核酸污染对荧光定量PCR检测限及灵敏度均无影响,操作简便快速,降低了PCR检测的假阳性概率,能及时准确地诊断颅内细菌感染.