靶向人血管内皮生长因子A基因小片段干扰RNA慢病毒载体的构建、比较及鉴定

目的 构建人血管内皮生长因子(VEGF) mRNA靶向小片段干扰RNA(siRNA)表达的慢病毒载体,并测定其对VEGFA基因的沉默率,选择效率最高的干扰序列.方法 设计3种人VEGFA靶向的发夹样siRNA(KD1、KD2、KD3),分别2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pGCSIL-GFP载体,转化扩增后得到重组载体pGCSIL-GFP-siVEGFA,进行测序.将重组载体与慢病毒包装辅助质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0通过Lipofectamine 2000共同转染至细胞人胚肾细胞株(293T),产生病毒后,再转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),逆转录-聚合酶链反应法检测转染细胞VEGFA mRNA的表达水平,比较3种siRNA序列的效率.结果 经过酶切鉴定与测序,pGCSIL-GFP-siVEGFA构建成功.转染至HVUEC后,细胞VEGFA mRNA表达水平均明显降低(KD1:0.614±0.043;KD2:0.334±0.030;KD3:0.201±0.015),其中以KD3为相对最有效的siRNA序列.结论 成功构建了针对VEGFA mRNA的siRNA载体,并可以显著抑制内皮细胞VEGFA mRNA的表达.