CRISPR/Cas9系统构建的水稻OsPht基因突变体材料可用于养分转运评价

[目的]CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为免受外来DNA片段侵袭形成的一种适应性免疫系统.CRISPR/Cas9已经被作为一种基因编辑的工具广泛应用到很多动物和植物的基因编辑.磷元素是植物生长过程中必需的营养元素,植物对磷的吸收主要由跨膜磷转运蛋白完成.本研究利用CRISPR/Cas9技术对Oryza Japonica Kitaake水稻中冰叶日中花磷转运蛋白McPht基因的同源体OsPht磷转运蛋白基因进行编辑,构建了McPht转运蛋白基因导入水稻OsPht缺失的突变体,初步验证了该突变体材料的功能.[方法]通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将水稻中与McPht蛋白同源性最高的磷转运蛋白基因进行编辑.首先将待编辑的基因片段连接到U3启动子驱动的pCXUN表达载体上,转化到农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌转化到水稻幼胚,将获得的转化后再生T0代株系移栽到田间获得T1代种子,并将T1代株系进行盆栽培养,提取株系叶片基因组DNA用于PCR检测,所有株系PCR产物纯化后进行测序,依据序列变化判定目标基因的编辑位点,并对突变体进行生理指标测定.[结果]1)基因编辑后的类型可分为两类,一类为目标编辑片段20个碱基中后6个碱基缺失,另一类为目标编辑片段20个碱基中后8个碱基缺失或突变.2)编辑位点缺失6个碱基的株系占总突变株系的28.6%,编辑位点缺失8个碱基的株系占总突变株系的42.9%,GT碱基突变株系占总突变株系的28.6%.3)水稻突变体的株高、鲜重、根系活力均小于野生型;根系扫描结果显示水稻突变体的根长、投影面积、表面积和侧根数均大于野生型;Cas-2的叶绿素和可溶性糖含量显著高于野生型,Cas-7的叶绿素和可溶性糖含量小于野生型,但差异不显著.[结论]CRISPR/Cas9基因编辑系统成功将水稻中McPht的同源体OsPht基因进行了编辑,所获得的水稻磷转运蛋白OsPht基因碱基缺失或突变不仅为所编辑基因的功能研究提供有效的科学依据,同时为冰叶日中花McPht磷转运蛋白基因导入OsPht基因功能缺失的水稻株系、验证其生理生化功能提供宝贵的评价材料支持.本研究表明基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统在功能性评价植物养分转运蛋白基因方面是一条有效的途径.