基于环介导等温扩增技术检测由强雄腐霉引起的玉米茎腐病

为建立强雄腐霉Pythium arrhenomanes的快速分子检测技术,基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以β-tubulin基因为靶标序列,设计强雄腐霉的特异性引物,建立了一种准确快速的LAMP检测方法,并对该检测方法的特异性、灵敏度和实际应用效果进行评估.25 μL LAMP最终反应体系为:10×ThermoPol Buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 3.5 μL、6 mmol/L MgSO42μL、5 mol/L甜菜碱4μL、40 μmol/L FIP-1/BIP-1各1 μL、5μmol/L F3-1和B3-1各1 μL、40 μmol/L LB-1 1μL、Bst DNA polymerase lμL、2.5 mmol/L HNB 1.9 μL、模板DNA 2 μL、灭菌水3.1 μL.LAMP体系在等温64℃条件下反应60 min,HNB显色反应显示天蓝色即为阳性反应;扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应.特异性检测结果显示,LAMP体系能特异性地检测出强雄腐霉,而其它卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检测出.灵敏度检测结果显示,LAMP体系的最低检测灵敏度为10 pg/μL,是普通PCR反应灵敏度的1 000倍.在实际应用中,LAMP体系能够快速检测出人工接种和实际发病玉米组织中的病原菌.表明本研究建立的快速、准确、可视化的LAMP检测方法能在60 min内检测出强雄腐霉.